輔助生殖技術(shù)--卵母細(xì)胞冷凍的現(xiàn)狀
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卵母細(xì)胞冷凍的成功依賴于影響卵母細(xì)胞冷凍后復(fù)蘇的形態(tài)學(xué)和生理上的因素。人類(lèi)卵母細(xì)胞，對(duì)低溫非常敏感，因?yàn)槠潴w積及生理方面的因素,在細(xì)胞內(nèi)冰晶形成過(guò)程中，很容易遭受死亡或亞死亡性損傷。重要的生理因素是細(xì)胞在冷凍過(guò)程中冰晶形成導(dǎo)致的細(xì)胞膜或細(xì)胞器破裂,但適當(dāng)?shù)募?xì)胞脫水可阻止這種情況，因此減少細(xì)胞內(nèi)的水分可減輕冷凍過(guò)程對(duì)細(xì)胞的損傷。脫水的過(guò)程受平衡液及冷凍液的濃度影響，在細(xì)胞脫水時(shí)兩者比例合適,可減少冰晶造成的損傷、滲透壓改變?cè)斐傻膿p傷、細(xì)胞骨架和染色體的改變等，zui后細(xì)胞在經(jīng)歷冷凍過(guò)程后存活[1]。
對(duì)冷凍保護(hù)劑的研究一直未間斷過(guò)。冷凍保護(hù)劑是一種合理的鹽類(lèi)緩沖液,似乎可減少高鹽對(duì)細(xì)胞的損害。冷凍保護(hù)劑包括:滲透性保護(hù)劑,如丙二醇(propanediol ,PROH)、乙二醇(ethylene glycol，EG)、二甲亞砜( dimethyl sulfoxide , DMSO)等;非滲透性保護(hù)劑,如蔗糖、海藻糖、聚乙二醇等。聯(lián)合使用玻璃化冷凍保護(hù)劑可降低毒性，提高保護(hù)作用。如Gautam等[2]采用玻璃化冷凍及慢速冷凍牛卵細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn),EG和DMSO混合物是一種有效冷凍保護(hù)劑，使用這種冷凍保護(hù)劑可提高卵細(xì)胞存活率、卵裂率及囊胚形成率,玻璃化冷凍程序配合合理冷凍保護(hù)劑更適宜卵母細(xì)胞冷凍。玻璃化冷凍的基本原理是高濃度冷凍保護(hù)劑經(jīng)急速降溫后,由液態(tài)轉(zhuǎn)化為外形類(lèi)似玻璃化的非晶體化固體狀態(tài)。由于冷卻諫度很快，以至干在低溫形成透明的玻璃狀周體時(shí)沒(méi)有冰晶形成,保留細(xì)胞內(nèi)外液體正常的分子和離子分布。適宜的冷凍保護(hù)液是目前玻璃化冷凍卵母細(xì)胞的焦點(diǎn)，而海藻糖在此方面表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)并逐漸得到重視。
海藻糖在冷凍卵母細(xì)胞中的應(yīng)用
Eroglu等研究發(fā)現(xiàn),使用0.5mmol/L的海藻糖聯(lián)合0.5mmol/L的DMSO對(duì)人類(lèi)卵子進(jìn)行玻璃化冷凍，結(jié)果冷凍后卵母細(xì)胞獲得較高的成活率,而與新鮮卵母細(xì)胞比在受精率和胚胎發(fā)育率上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
Eroglu等研究小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)注射0.1mol/L的海藻糖,利用高xiao液相色譜和脈沖電流檢測(cè)儀對(duì)卵母細(xì)胞內(nèi)的海藻糖行追蹤研究。研究發(fā)現(xiàn),在卵母細(xì)胞第1次卵裂時(shí)卵母細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖濃度明顯高于對(duì)照組,且胞內(nèi)海藻糖濃度減少40%;而在注射早期以及囊胚形成期兩者胞內(nèi)的葡萄糖濃度的差異不大，海藻糖的濃度在囊胚階段減少5倍。這種不同可以解釋為海藻糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖的代謝和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)增加,使胞內(nèi)海藻糖濃度減少。卵裂時(shí)海藻糖由二糖轉(zhuǎn)變?yōu)閱翁枪┞涯讣?xì)胞利用,而對(duì)卵母細(xì)胞本身無(wú)任何du害作用。
Berlinguer等對(duì)未成熟的羊卵進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)用海藻糖添加的體外成熟培養(yǎng)基中成熟的羊卵與未使用海藻糖對(duì)照組比，受精率(92.5%比91.1%)
卵裂率(95.4%比96. 1% )囊胚形成率(13%比14.3%)無(wú)明顯差異,但利用碘化丙啶(propidium iodide ,PI)對(duì)細(xì)胞染色發(fā)現(xiàn),海藻糖組細(xì)胞完整性明顯高于對(duì)照組,說(shuō)明在穩(wěn)定細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)、冷凍和復(fù)蘇過(guò)程中的發(fā)育潛能方面,海藻糖組羊卵未受到影響。
Hamaratoglu等[7]認(rèn)為,海星卵母細(xì)胞在慢速冷凍過(guò)程中很容易死亡,原因是這種卵母細(xì)胞對(duì)滲透壓高度敏感和在零下溫度極易形成胞內(nèi)的冰晶,所以普通冷凍方法無(wú)作用。研究發(fā)現(xiàn),將卵母細(xì)胞短暫放置于1.5mol/LDMSO和1mol/L的海藻糖中快速冷凍,結(jié)果34%卵母細(xì)胞成活。說(shuō)明新的用于海星卵母細(xì)胞冷凍的方法是可行的。
海藻糖是生物大分子非特異性的天然保護(hù)劑，其在生物領(lǐng)域特別是卵母細(xì)胞的玻璃化冷凍方面有更加廣fan的應(yīng)用前景。進(jìn)-步尋找有效且安全的海藻糖載入卵母細(xì)胞內(nèi)的方法,在聯(lián)合其他滲透性保護(hù)劑的基礎(chǔ)上利用海藻糖特殊的功能對(duì)卵母細(xì)胞冷凍保存,探索到一種更適合于冷凍卵母細(xì)胞的方法,為人類(lèi)輔助生殖技術(shù)的發(fā)展提供動(dòng)力。
為什么海藻糖可以被應(yīng)用到冷凍卵母細(xì)胞中？這就得從海藻糖的應(yīng)用原理說(shuō)起。
在高溫、高寒、高滲透壓及干燥、脫水、冷凍時(shí)等惡劣環(huán)境條件下，海藻糖在細(xì)胞表面能形成*的保護(hù)膜，有效地保護(hù)蛋白質(zhì)分子不變性失活，從而維持生命體的生命過(guò)程和生物特征。目前海藻糖已用于多種生物細(xì)胞研究，如：紅細(xì)胞、血小板及生殖細(xì)胞等的離體長(zhǎng)期保存，且均表現(xiàn)出*的功能。海藻糖的發(fā)現(xiàn)為低溫保存卵母細(xì)胞提供可利用的價(jià)值，其作為冷凍保護(hù)劑對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍成為新的冷凍技術(shù)方法。海藻糖的作用原理包括：“水替代”假說(shuō)、“玻璃態(tài)”假說(shuō)、“優(yōu)先排阻”假說(shuō)。
“水替代”假說(shuō)。認(rèn)為,海藻糖能與生物分子形成氫鍵,代替空間結(jié)構(gòu)必需的水分子。即生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)核酸、糖類(lèi)、脂質(zhì)類(lèi)及其他生物大分子周?chē)粚铀?這層水膜是維持生物大分子結(jié)構(gòu)、功能的物質(zhì)基礎(chǔ),當(dāng)干燥、冷凍等條件下失去水膜時(shí),海藻糖分子能在失水部位與生物大分子以氫鍵連接,形成一層保護(hù)膜代替失去的結(jié)構(gòu)水膜,而不至于使生物分子喪失活性[1]。
“玻璃態(tài)”假說(shuō)。海藻糖的高xiao生物保護(hù)作用與其玻璃態(tài)形成有關(guān)。海藻糖水溶液干燥時(shí)黏度隨濃度的增加而增大，當(dāng)達(dá)到一定濃度且糖未結(jié)晶時(shí)，其水溶液就會(huì)玻璃化,這種狀態(tài)稱為玻璃態(tài)。“玻璃態(tài)”假說(shuō)認(rèn)為,當(dāng)生物成分干燥時(shí),海藻糖緊密地包住相鄰的分子,形成一種在結(jié)構(gòu)上與玻璃狀的冰類(lèi)似的碳水化合物玻璃體,其擴(kuò)散系數(shù)很低,分子運(yùn)動(dòng)和分子變性非常微弱,能夠使生物分子維持-定的空間結(jié)構(gòu)[2]。
“優(yōu)先排阻”假說(shuō)。海藻糖等小分子糖類(lèi)不直接與蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)相互作用,而是優(yōu)先與蛋白質(zhì)表面的水分子結(jié)合，結(jié)果蛋白質(zhì)的溶劑化層半徑減小，分子結(jié)構(gòu)更緊密,構(gòu)象更穩(wěn)定,有利于抵御外界環(huán)境的影響。該假說(shuō)可解釋溶液中海藻糖對(duì)生物分子的穩(wěn)定作用。海藻糖水合體積為蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖的2.5倍,在溶液中可結(jié)合更多的水分子。這-結(jié)果可很好地解釋海藻糖保護(hù)生物分子的效果優(yōu)于其他低聚糖的原因[3]。
