海藻糖——高效無毒的細胞冷凍保護劑

包括干細胞在內(nèi)的細胞**產(chǎn)品具有很高的臨床潛力，全球干細胞市場包括上中游的干細胞存儲制備以及下游的臨床應用。

為了使細胞**產(chǎn)品成功應用，細胞的長期低溫存儲是必須攻克的技術(shù)難點，因為低溫保存是長期保存細胞活力和生化功能的**可用方法。為了避免細胞內(nèi)結(jié)冰對細胞結(jié)構(gòu)的損害，一些生物制劑凍干保護劑，冷凍保護劑已經(jīng)上市。*常用的生物制劑凍干保護劑，冷凍保護劑是二甲基亞砜(DMSO)與胎牛血清或血清替代品聯(lián)合使用。

然而，胎牛血清含有異種動物源蛋白，可能會引起未知病原體的人畜共患**。此外，DMSO具有細胞毒性。據(jù)報道，DMSO對組織和細胞的毒性取決于暴露時間、溫度和濃度。毒性程度因細胞類型而異，在未去除DMSO的情況下再次注入解凍細胞的患者中有不良反應的報道。此外，已知DMSO會通過調(diào)節(jié)三種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(Dnmts)的轉(zhuǎn)錄水平和改變?nèi)蚪M甲基化譜來影響小鼠胚狀體的表觀基因組，進而導致小鼠干細胞的不受控分化。因此二甲基亞砜+胎牛血清并不適合臨床使用，急需開發(fā)高效無毒的生物制劑凍干保護劑，細胞冷凍保護劑。

海藻糖生物制劑凍干保護劑是一種非還原性雙糖，存在于多種能夠在wan全脫水狀態(tài)下存活的生物中，如細菌、酵母、緩步動物和線蟲。哺乳動物不產(chǎn)生海藻糖，但海藻糖確實是一種有效的冷凍保護劑，可以減少冰晶形成造成的細胞損傷。其保護作用既與滲透效應有關(guān)，也與細胞膜磷脂和不穩(wěn)定蛋白的特異性相互作用有關(guān)，可防止其因干燥和氧化應激而損傷和變性。

海藻糖生物制劑凍干保護劑不具有細胞毒性，已被有效地用于小鼠精細胞、成人造血干細胞，間質(zhì)干細胞，脂肪來源干細胞，人類胚胎干細胞(hESCs) 和人類誘導多能干細胞(hiPSCs) 等不同細胞類型的冷凍儲存。此外，海藻糖生物制劑凍干保護劑還用于臍帶血、骨髓、人類移植表肝細胞和人類胰島的冷凍儲存。

阻止海藻糖在細胞保存中廣泛應用的主要障礙是其難以進入細胞內(nèi)部。以前已經(jīng)應用了幾種方法，如滲透休克、脂質(zhì)體遞送、熱穿孔、電穿孔、微量注射和基因工程等方式來幫助海藻糖進入細胞內(nèi)部。然而，上述方法需要非常繁瑣的操作，費力耗時，且可能導致**的細胞損傷。

該研究探究了在沒有二甲基亞砜及胎牛血清的情況下，使用海藻糖單獨或與乙二醇(乙二醇)或甘油(甘油)聯(lián)合，配制了4種不同的海藻糖復合型冷凍保護劑，低溫保存3種不同類型的多能干細胞系并復蘇，對幾個關(guān)鍵參數(shù)進行了**研究，包括細胞形態(tài)、解凍后生存能力、多能性標記物表達水平、基因組穩(wěn)定性、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)穩(wěn)態(tài)、DNA損傷反應等，以衡量不同海藻糖復合型冷凍保護劑對多能干細胞的低溫保護能力。

1. 不同冷凍保護劑組成

所有冷凍保護劑均現(xiàn)用現(xiàn)配，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋。實驗中用到的細胞均使用CS10冷凍保存。CS10是一種無血清，無動物源成分，含有10% DMSO，推薦用于人類多能干細胞(hPSCs)的冷凍保護劑。

2. 細胞的冷凍保存及解凍

細胞在特定條件下培養(yǎng)，用0.5 mM EDTA解離hESCs RC17，用細胞消化液解離hiPSCs CTR2#6和AF22，并在新鮮制備的冷凍保護劑(A,B,C和D)中處理。2.0×10^6細胞在每種冷凍保護劑1.5 mL中重懸，然后轉(zhuǎn)移到低溫小瓶中。

低溫小瓶使用冷凍容器進行冷卻，該容器冷卻速率約為-1°C/min，放置過夜后，轉(zhuǎn)移到- 80°C冰箱。再24小時后，將低溫小瓶轉(zhuǎn)移到液氮中，并在分析前存儲至少一周。

解凍時，取出低溫小瓶，37°C水浴加熱直至冰團消失，細胞懸液用溫暖的培養(yǎng)基稀釋。以200g離心3分鐘收集細胞，并以zhi定的接種量將其接種到適合每種細胞類型的包被培養(yǎng)容器上。

3. 結(jié)果與討論

①細胞活力

解凍48?h后，用阿拉瑪藍法測定細胞活力。

首先，為了確定海藻糖、乙二醇、甘油單獨使用時的適宜用量。在不同干細胞系中分別使用不同濃度的單組分溶液，測試細胞復蘇后的活力并與對照組進行比對。結(jié)果表明0.5M 海藻糖，10%乙二醇和10%甘油是較為適宜的濃度，但在不同的干細胞類型之間存在很大的差異。

確定初始濃度后，選定4種冷凍保護劑配方（詳見上文），對三種干細胞系(A) hESCs-RC17， (B) hiPSCs-CTR2#6和(C) ltNES-AF22進行冷凍保存及復蘇，進行細胞冷凍復蘇后活力檢測。并將細胞存活率與在CS10中冷凍保存的相同細胞在相同條件下進行比較。

當細胞*用海藻糖(冷凍保護劑A組)冷凍保存時，解凍后的細胞恢復率降低，不同干細胞類型的細胞恢復率從20%到60%不等。

在以海藻糖為基礎的培養(yǎng)基中添加10% 乙二醇或甘油時(冷凍保護劑C組、D組)，RC17和AF22細胞的細胞存活率都達到了與DMSO相似的水平，而在CTR2#6中，甘油的細胞存活率優(yōu)于乙二醇。

此外，對比*由乙二醇或甘油組成的對照冷凍溶液的實驗結(jié)果，可以確認細胞存活率的增加是乙二醇/甘油+海藻糖聯(lián)合作用的結(jié)果。

這些結(jié)果表明，海藻糖可以有效地用于人類多能干細胞的冷凍保存，有望替代DMSO，添加10% 乙二醇或甘油可**提高海藻糖冷凍保護劑的存活率。與對照組CS10相比，細胞平均存活率增加。乙二醇/甘油+海藻糖組成的冷凍保護劑不含血清蛋白，避免了先前報道的刺激多能干細胞過早分化的風險。

②細胞形態(tài)

干細胞凍存另一個重點關(guān)注的問題是染色體和多能性改變。冷凍和解凍過程可能在細胞內(nèi)外形成冰晶和氣泡，破壞紡錘體微管進而誘導染色體異常分離，導致細胞生長特征和形態(tài)變化。因此，可通過觀察凍存復蘇后的細胞形態(tài)來較為直觀地評估干細胞染色體及多能潛力受到損害的可能性。

上圖顯示了解凍48小時后RC17、CTR2#6和AF22的細胞形態(tài)。相位對比圖像證實，在所有細胞系中，海藻糖復合冷凍保護劑均未引起明顯的形態(tài)變化，細胞形態(tài)與CS10中保存的細胞相同。

③標志物表達水平

為了確認凍存復蘇后的RC17、hiPSCs CTR2#6和AF22保留了多能干細胞的關(guān)鍵性質(zhì)和特征，在解凍48 h后通過定量RT-PCR分析幾個標記物的表達水平。

對RC17和CTR2#6細胞檢測細胞標記Nanog, Oct4和Sox2。與對照組進行比對。

對AF22細胞檢測細胞標記Nestin和Sox2。與對照組進行比對。結(jié)果顯示干細胞分化潛能未受影響。

④染色體穩(wěn)定性

為了評估海藻糖冷凍保護劑對干細胞染色體穩(wěn)定性的影響，對所有三種干細胞系進行常規(guī)核型分型和aCGH，下圖為AF22細胞系儲存前后的結(jié)果。

總體而言核型保持穩(wěn)定，但檢測到少量CNVs(染色體2、8、19和22)，其中一些可能已經(jīng)存在于原始細胞群中，另一些可能是在細胞體外操作過程中隨機產(chǎn)生的，而不是冷凍保存導致，因為在儲存前(圖C)和儲存后(圖D)均未觀察到克隆非整倍體或結(jié)構(gòu)染色體畸變。

⑤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激/未折疊蛋白水平評估

該研究還關(guān)注了在CS10或海藻糖中低溫保存是否會對多能細胞響應內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和**UPR通路的能力產(chǎn)生負面影響。為了在不同的生理或病理狀態(tài)下維持穩(wěn)態(tài)，ER整合了各種分子和細胞信號。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和UPR都介導影響細胞增殖、分化和凋亡的分子和生化機制。

總體而言，與對照組CS10相比，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激/UPR反應水平適中。**一種更敏感的細胞系是CTR2#6，在實驗組B和C中顯示出更高水平的BIP和CHOP水平。表明與CS10相比，海藻糖低溫保存不會明顯改變多能干細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）穩(wěn)態(tài)。

海藻糖（供注射用）（無菌）

1、產(chǎn)品名：海藻糖（供注射用）（無菌）

2、中文名稱：D(+)-海藻糖二水合物

3、英文名稱：D(+)-Trehalose dihydrate (for injection)

4、化學名稱：α-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡糖苷二水合物

5、型號：Hipo-S

6、含量測定：99.3%

7、CAS號：6138-23-4

8、EINECS登錄號：202-739-6

9、備案登記號：F20190000452

10、DMF號：034401

11、質(zhì)量標準：符合各國藥典標準（Chp,USP,JP,EP）

12、分子式：C12H22O11·2H2O

13、分子量：378.33

14、性狀：白色結(jié)晶性粉末

15、比旋度：+198.8°

16、酸度:6.0

17、氯化物:符合規(guī)定

18、硫酸鹽:符合規(guī)定

19、可溶性淀粉:符合規(guī)定

20、熾灼殘渣:0.04%

21、重金屬:符合規(guī)定

22、水分:9.5%

23、有關(guān)物質(zhì):總雜0.06%，葡萄糖未檢出，麥芽三糖0.06%，**未知單雜未檢出

24、無菌：符合規(guī)定

25、微生物限度：無菌

26、細菌內(nèi)：<0.1IU/g

27、氮：符合規(guī)定

28、含量測定：99.3%

29、溶解性：易溶于水，溶于熱乙醇，微溶于甲醇，不溶于**、**

30、保存：密封、涼暗干燥處保存，常溫條件下運輸。

31、貨號：008001

32、結(jié)構(gòu)式：